Během vzrušených debat kolem geneticky modifikovaných organismů (jeden příklad za všechny) občas zaznívá argument, že vědci neví, co jejich technologie v tělech organismů činí: "Vždyť ani nevíte, kam se vámi vnášený gen do dědičné informace zabuduje," vytýkali kritici. A vědci byli nuceni přiznat, že ve většině případů skutečně ne.
Mnohdy opravdu nedokázali přesně určit, kam se geny do DNA bakterií, rostlin, nebo živočichů vmáčknou. Nestáli však se založenýma rukama a pilně pracovali na molekulárních nástrojích, které by jim dovolily cílené zásahy do dědičné informace. A uspěli. Jestliže dříve se práce genových inženýrů tak trochu podobala "střelbě naslepo", dnes mají vědci k dispozici prostředky, které jim dovolují zásahy hodné Viléma Tella.
Systémy pro cílené zásahy do dědičné informace mají dvě základní součástky. Jednou jsou molekulární nůžky pro stříhání dvojité šroubovice DNA. Pro tento účel se používají enzymy označované jako nukleázy. Druhá, neméně důležitá část dokáže vyhledat jednoznačně určené místo mezi miliony či miliardami písmen genetického kódu, jež tvoří genom geneticky upravovaného organismu. Spojení tohoto "vyhledávače" s "nůžkami" vytváří "řízenou střelu", která zasáhne a přetne dvojitou šroubovici DNA v přesně vybraném místě.
Buňky takto vzniklou "díru" v genomu ihned opravují. Ale nejednou udělají při opravě chybu. I drobná změna, například vypadnutí jednoho písmene genetického kódu, může mít pro funkci chybně opravené DNA vážné následky. Pokud genový inženýr "přestřihne" dědičnou informaci v místě, kde se nachází gen, může být takto "havarovaný" gen i po opravě nefunkční.
Právě o cílené "mrzačení" genů vědcům často jde. Z následků vyvolaných poškozením genu se můžeme například dozvědět, co měl tento gen v organismu na práci. Uměle navozenou genovou havárií lze také vytvořit živočicha postiženého podobně jako lidé, kteří se narodili s poškozeným genem. Genové defekty stojí v pozadí mnoha závažných dědičných onemocnění, jako je cystická fibróza, hemofilie nebo Duchenneova svalová dystrofie. Další genetické defekty mohou významně zvyšovat rizika nádorových a jiných hojně rozšířených onemocnění. Zvířata s obdobně poškozenými geny jsou významnými pomocníky při studiu chorob, hledání léčebných postupů a testování léků.
Sklad americké armády se vzorky DNA jejích příslušníků a části smluvních zaměstnanců, která má umožnit jejich identifikaci v případě smrti ve službě. Databáze ročně odebere 350 tisíc vzorků a funguje od roku 1992. Likvidace první části záznamů proběhne v roce 2042, v té době bude v -21 stupních Celsia naskladováno cca 17 milionů vzorků.
Při vnášení genu na přesně určené místo dědičné informace je postup obdobný. Vhodný "vyhledávač" se spojí s "nůžkami" a takto vzniklá "řízená střela" zasáhne dvojitou šroubovici ve vybraném místě. Pokud genový inženýr zároveň dodá buňce gen, který by rád viděl v její dědičné informaci, může buňka při opravách "díry" v DNA použít podstrčený gen jako "záplatu". V té chvíli je záměr genového inženýra naplněn. Gen skončil v genomu na přesně určené "adrese".
V posledních letech se ve vývoji "řízených střel" pro cílené zásahy do dědičné informace odehrálo hned několik revolucí. Časové intervaly mezi nimi se zkracují. Než se vědci stačí nabažit jednoho systému, už se jim nabízí nový, lepší.
Delší dobu už slouží pro vyhledávání "adres" v genomech tzv. zinkové prsty. Ty jsou běžnou součástí složitých molekul bílkovin, jež se dokážou navázat na vybraná místa dědičné informace. K takovým bílkovinám patří tzv. transkripční faktory, jež uvádějí do činnosti jednotlivé geny.
Za vazbu bílkovinné molekuly na DNA jsou zodpovědné řetězce asi třiceti aminokyselin, které jsou prostorově uspořádány tak, aby mohly "sáhnout" na dané místo dědičné informace. Za své prostorové uspořádání vděčí vázaným iontům zinku. Tak také přišly k názvu "zinkový prst".
Jeden zinkový prst se váže na trojici písmen genetického kódu. Pokud vědci spojili čtyři zinkové prsty, pak si zajistili, že tato "čtyřprstá ruka" sáhne v genomu na místo, kde se nachází zcela konkrétní kombinace dvanácti písmen genetického kódu. Takových míst v dědičné informaci není mnoho a často je jen jedno. Když vědci připojí za "čtyřprstou ruku" ještě "nůžky" pro stříhání DNA, je "řízená střela" pro zásah cíle v dědičné informaci hotová. Nukleázy propojené se zinkovými prsty lze využít jak k narušení genu ve vybraném místě, tak i ke vnášení cizího genu na konkrétní "adresu" v genomu.
Vyhledávač založený na zinkových prstech má však řadu nectností. Vědcům se nedaří získat zinkové prsty pro některé kombinace písmen genetického kódu. V genomu tak zůstávaly velmi zajímavé adresy, na které zinkové prsty "nedosáhnou". Někdy se zinkové prsty na dvojité šroubovici "přehmátnou" a navedou "řízenou střelu" na špatný cíl. Příprava zinkových prstů je komplikovaná a drahá. V neposlední řadě brzdí je praktické využití brzděno i faktem, že rozhodující patenty vlastní jediná firma.
Významné vylepšení oproti zinkovým prstům přinesly "vyhledávače", okoukané od bakterií z rodu Xanthomonas. Tento původce onemocnění rostlin ovládá geny své oběti. Na určená místa dědičné informace hostitele přikládá bakterie své speciální bílkovinné molekuly, zkráceně označované jako TALE. Xanthomonas upravuje pomocí TALE chod genů rostliny tak, jak to vyhovuje jejím zištným zájmům.
Nedovyvinuté mušky octomilky připravené na injekci DNA
Vědcům se podařilo rozluštit, jaká musí být stavba proteinu TALE, aby se navázal na DNA s přesně určeným pořadím písmen genetického kódu. Pak mohli vytvářet umělé proteiny TALE, které uměly vyhledat v genomu nejrůznějších organismů zcela určité místo. Dařilo se dokonce vytvářet proteiny TALE schopné vazby na místa, pro která se nedala zkonstruovat spolehlivá "ruka" ze zinkových prstů. To byl jasný signál, aby se vědci pokusili spojit protein TALE s "nůžkami" na DNA. Vznikla tak nová "řízená střela" pro cílené zásahy do dědičné informace, která využívá proteiny TALE jako "vyhledávače". Nůžky v podobě enzymu nukleázy zůstaly stejné jako u nástrojů využívajících k vyhledávání konkrétní "adresy" v DNA zinkových prstů.
Výsledky pokusů s těmito "řízenými střelami", označovanými jako TALEN, přinesly takové zvýšení účinnosti a přesnosti zásahů do dědičné informace nejrůznějších organismů, že vědecký týdeník Science zařadil tento nástroj genových inženýrů na třetí místo mezi deseti vědeckými průlomy roku 2012. Ale v závěru zprávy o bronzové medaili pro TALEN už redaktoři Science avizují nástup další techniky pro cílené zásahy do DNA, která může i bronzem ověnčenou "řízenou střelu" rychle poslat do starého železa.
Na počátku vzniku nové "řízené střely" stál objev velmi důmyslného mechanismu, kterým se bakterie brání nejrůznějším vetřelcům, především pak virům ze skupiny bakteriofágů. Ukázalo se, že když bakterie přežila atak fágu, napodruhé se s tímto mikroskopickým nepřítelem vypořádá o poznání snáz. Získá proti viru "imunitu".
Bakterie si ji zajistí tak, že posbírá úlomky dědičné informace fágu, tvořené 30 až 60 písmeny genetického kódu, a nastrká si je do vlastní dědičné informace. Aby si v nich udržela pořádek, proloží je "zarážkami" z vlastní DNA. Tyto úseky dědičné informace označované jako CRISPR se vyskytují na více místech dědičné informace bakterie a mohou obsahovat až stovku "nasekaných" porcí fágu.
Pokud do bakterie pronikne virus, jehož dědičná informace obsahuje úseky shodné s "porcemi" přemoženého viru uloženými v "archivu" CRISPR, pak začne bakterie podle archivovaných úseků vyrábět dlouhou molekulu ribonukleové kyseliny (RNA). Buňka vzápětí rozdělí dlouhou RNA na spoustu krátkých molekul tvořených zhruba 60 písmeny genetického kódu. Tyto krátké RNA se spojí s enzymem Cas, který funguje jako molekulární nůžky na DNA a je určen právě pro tyto účely.
Krátká molekula RNA funguje jako vynikají "vyhledávač", který dovede "nůžky" proteinu Cas na přesně vybrané místo v dědičné informaci viru. Nůžky pak střihem vytvoří v dědičné informaci viru díru, a zasadí mu tak smrtelný úder. O významu "imunitního systému" CRISPR svědčí skutečnost, že byl odhalen v arzenálu významné části mikrobiálního světa. Mikrobi si mohou tyto "archivy" se zlomky DNA vetřelců navzájem předávat a vyměňovat, což napomáhá šíření bakteriální imunity proti virům.
Hned několik vědeckých týmů si uvědomilo, že spojením vyhledávače tvořeného malou molekulou RNA a molekulárních nůžek Cas vyrobila příroda "řízenou střelu", která se dokonale hodí pro potřeby genových inženýrů. "Vyhledávač" z RNA má oproti proteinovým "vyhledávačům" celou řadu výhod.
Je prakticky neomylný. Stačí, aby v daném úseku DNA nesedělo jediné písmeno genetického kódu a "crisprová" RNA ho ignoruje. Výroba krátkých RNA je neskonale jednodušší a lacinější než výroba bílkovinných zinkových prstů či TALE. V neposlední řadě je vyhledávač na bázi RNA mnohonásobně menší než jeho bílkovinní konkurenti. Díky tomu snáze proniká do nitra buněk. Pro "řízené střely" s rozměrným vyhledávačem v podobě "ruky" ze zinkových prstů nebo TALE představuje cesta do nitra buněk někdy zapeklitý úkol.
Důkazů, že systém tvořený vyhledávačem CRISPR a nůžkami Cas lze využít k zásahům nejen do buněk bakterií, ale také do buněk živočichů a člověka, rychle přibývá. Vědci jsou v prognózách opatrní, ale vesměs se shodují, že na poli cílených zásahů do dědičné informace provedli "genetičtí Vilémové Tellové" další revoluci. Rýsují se možnosti, že najde uplatnění i v tzv. genových terapiích, kdy lékaři korigují vrozené defekty v dědičné informaci.
Kdo chvíli stál, už stojí opodál
Radost z rychlého pokroku evropským vědcům trochu kazí skutečnost, že nevědí, jestli se na organismy s dědičnou informací upravenou pomocí "řízené střely" CRISPR-Cas vztahují velmi přísné zákony pro regulaci používání geneticky modifikovaných organismů v zemích Evropské unie. O tom, zda organismus s upravenou dědičnou informací patří mezi přísně kontrolovanou hordu "geneticky modifikovaných organismů" (GMO) rozhoduje v EU to, jaká technika byla k úpravě dědičné informace použita.
Existuje seznam technik, kterými vznikají organismy házené do pytle GMO. Patří tam například tradiční genetická modifikace rostlin pomocí geneticky upravené bakterie Agrobacterium tumefaciens nebo změny v dědičné informaci zvířat navozené pomocí geneticky upravených virů. Ale nepatří tam třeba změny dědičné informace vyvolané v organismech jejich úmyslným vystavením radioaktivnímu záření. Přitom ozářením je v dědičné informaci navozen bezpočet těžko definovatelných změn. Jestliže "řízená střela" CRIPR-Cas zasahuje do genomu s přesností hodináře, radiace působí na dědičnou informaci jako výstřel z brokovnice.
Jaroslav PetrPracuje jako vedoucí výzkumný pracovník ve Výzkumném ústavu živočišné výroby v Praze-Uhříněvsi, kde se zabývá reprodukční biologií a biotechnologiemi hospodářských zvířat. Externě přednáší na České zemědělské universitě v Praze a dalších institucích. Je také dlouholetým popularizátorem vědy. Píše například pro Lidové noviny, časopis Vesmír i server Osel.cz. |
Rozhodování, zda daná technika pro zásahy do dědičné informace bude, či nebude zařazena na seznam genetických modifikací, je zdlouhavé. Po několika letech práce mezinárodní komise expertů není zatím oficiálně rozhodnuto ani o "řízených střelách" na bázi zinkových prstů. Vzhledem k tomu, že je komise expertů přetížena hodnocením starých technik, nové techniky, včetně TALEN a CRISPR-Cas, se ještě nedostaly na pořad jednání.
Evropští vědci tak asi zůstanou ještě nějakou dobu v nejistotě, co že to vlastně ve svých laboratořích dělají. Jsou to genetické modifikace a máme na ně být přísní, jak nám velí evropská legislativa? Nebo to nejsou genetické modifikace, a můžeme tak s nimi zacházet stejně bezstarostně jako s organismy, z jejichž genů jsme nadělali řešeto radioaktivním zářením?
Svět na naše rozhodnutí nečeká a vyvíjí další a ještě lepší techniky. S jejich pomocí získává nové mikroorganismy pro výrobu léků, nové plodiny zajištující vyšší úrodu a zdravější potraviny nebo nové postupy pro léčbu mnoha závažných onemocnění zásahem do DNA pacienta.
Jan Neruda byl ve "století páry" přesvědčen, že "kdo chvilku stál, už stojí opodál". Můžeme si v 21. století dovolit postávat na místě nikoli chvilku, ale rovnou několik let? A ocitneme se za tu dobu jen "opodál" nebo někde úplně jinde?
